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如何確認(rèn)RNA的質(zhì)量?

 更新時(shí)間:2023-10-10 點(diǎn)擊量:950

樣本種類(lèi)繁多且復(fù)雜,有些樣本,要想提取到質(zhì)量良好的RNA是非常困難的,那么該如何確認(rèn)RNA的質(zhì)量呢?讓我們一起來(lái)看看吧!

確認(rèn)RNA的質(zhì)量有以下兩種常見(jiàn)方法

1)檢測(cè)RNA溶液的吸光度

280、320230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景(溶液渾濁度)、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。一般的,我們只看OD260/OD280RatioR)。

1.82.0時(shí),我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的,不過(guò)要注意,當(dāng)你用Tris作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí),R值可能會(huì)大于2(一般應(yīng)該是<2.2的)。當(dāng)R<1.8時(shí),溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯,你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運(yùn)。當(dāng)R>2.2時(shí),說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。

2RNA的電泳圖譜

一般來(lái)說(shuō),RNA的電泳都是用變性膠進(jìn)行的,但是根據(jù)經(jīng)驗(yàn),如果你僅僅是為了檢測(cè)RNA的質(zhì)量是沒(méi)有必要進(jìn)行如此麻煩的實(shí)驗(yàn)的,用普通的瓊脂糖膠就可以了。

電泳的目的是在于檢測(cè)28S18S條帶的完整性和他們的比值,或者是mRNA smear的完整性。一般來(lái)說(shuō),如果28S18S條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰),并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上,我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的。

以上是我們常用的兩種方法,但是這兩種方法都無(wú)法明確的告訴我們RNA溶液中有沒(méi)有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶,用以上方法我們很難察覺(jué),但是大部分后續(xù)的酶學(xué)反應(yīng)都是在37度以上并且是長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行的。這樣,如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶,那么在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中就會(huì)受到殘留的RNA酶的干擾,從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗

下面,我們介紹一個(gè)可以確認(rèn)RNA溶液中有沒(méi)有殘留的RNA酶的方法。

3)保溫試驗(yàn)

按照樣品濃度,從RNA溶液中吸取兩份1000 ngRNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0Tris緩沖液補(bǔ)充到10 ul的總體積,然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。

1h后取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后,比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無(wú)明顯差別(當(dāng)然,它們的條帶也要符合方法2中的條件),則說(shuō)明RNA溶液中沒(méi)有殘留的RNA酶污染,RNA的質(zhì)量很好。相反,如果70℃保溫的樣本有明顯的降解,則說(shuō)明RNA溶液中有RNA酶污染。

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